Молекулярная диагностика генетических заболеваний: что это, методы, особенности, область применения

Расшифровка генома человека стала настоящим прорывом ХХ века: мир узнал о том, как заложенный «код» влияет на каждого из нас. И пусть ученые до сих пор ведут споры вокруг этой темы, мы уже можем оценить результаты многолетних исследований: любому человеку стала доступна молекулярно-генетическая диагностика.

Как узнать свой личный «код» и для чего это нужно? Об этом мы расскажем в данной статье.

Что такое молекулярно-генетическая диагностика

Итак, молекулярно-генетическая диагностика — сравнительно новый метод обследования организма, позволяющий точно и быстро выявить вирусы и инфекции, мутации генов, вызывающих патологию, оценить риски наследственных и иных заболеваний. И это далеко не полный спектр возможностей исследования ДНК.

Важнейшим достоинством молекулярно-генетической диагностики является минимальная степень медицинского вмешательства, поскольку исследование проводят in vitro. Метод успешно применяют даже для диагностики заболеваний у эмбрионов, а также у ослабленных и тяжелобольных пациентов. Самый распространенный материал для исследования — кровь из вены, однако возможно выделение ДНК/РНК из других жидкостей и тканей: слюны, соскоба слизистой рта, выделений из половых органов, околоплодной жидкости, волос, ногтей и т.д.

Молекулярная диагностика — значительный шаг к персонализированной медицине, она позволяет учитывать все особенности конкретного пациента при обследовании и терапии.

Области медицинского применения методов молекулярной диагностики

Итак, исследование ДНК/РНК используется во многих разделах медицины. Давайте рассмотрим задачи и области, в которых активно применяют молекулярную диагностику:

  • Выявление существующих патологий. Например, к молекулярной диагностике прибегают в тех случаях, когда инфекционное или вирусное заболевание не может быть определено обычными методами. Она позволяет обнаружить болезнь даже на ранней стадии, когда внешних проявлений нет.
  • Исследование аллергических реакций. Молекулярная диагностика успешно применяется для определения аллергии: в отличие от традиционных методов, она более точна и при этом безопасна для пациента, так как отсутствует непосредственный контакт с аллергеном.
  • Индивидуальная оценка рисков развития наследственных заболеваний. Молекулярная диагностика помогает выявить у взрослых и детей опасность в будущем подвергнуться различным патологиям. Нужно отметить, что есть болезни, которые вызваны исключительно мутацией гена (моногенные) и те, которые обусловлены в том числе генетическими особенностями (мультифакторные). Информация о первых позволяет, к примеру, оценить риски передачи наследственных заболеваний от родителей к ребенку. Знание о предрасположенности к мультифакторной патологии необходимо еще и для профилактики болезней с помощью изменения образа жизни.
  • Перинатальная медицина. Как уже было сказано, молекулярная диагностика способна дать информацию о состоянии здоровья и генетических предрасположенностях человека. Это относится и к эмбрионам: анализ ДНК еще не родившегося ребенка позволяет распознать синдромы Дауна, Эдвардса, Патау, Тернера, Клайнфельтера. Также молекулярная диагностика применяется в области вспомогательных репродуктивных технологий: она позволяет установить генетические причины бесплодия и невынашивания беременности.
  • Фармакогенетика. Молекулярная диагностика объясняет, почему на некоторых действуют одни препараты, а на других — иные: все дело в генетических особенностях пациентов. Возможность определения эффективности веществ имеет особое значение при лечении тяжелых заболеваний, например, онкологических.
  • Спортивная медицина. Настоящие чудеса исследования ДНК и РНК творят и в области оценки спортивных перспектив. Например, родители малышей могут узнать о том, какой вид занятий принесет ребенку наибольшую пользу для здоровья или позволит достичь спортивных результатов.

Когда проводится генетическое исследование

Итак, обращение к генетическим исследованиям актуально в тех случаях, когда пациент стремится получить сведения о состоянии своего организма. Обычно это необходимо в следующих ситуациях:

  • для постановки точного диагноза. Например, очень распространенным является неверное определение аллергена либо несвоевременная диагностика вирусного заболевания. Между тем от этого зависит успешность лечения;
  • для профилактики возможных патологий. Если пациенту известно о повышенном риске сердечно-сосудистых заболеваний или рака, он может предпринимать соответствующие меры, например, отказаться от вредных привычек;
  • для повышения эффективности лечения. К примеру, онкозаболевания имеют множество вариантов терапии. Выбор тактики лечения «методом проб и ошибок» приводит к потере драгоценного времени и здоровья, а иногда — и к летальному исходу;

Отдельной группой стоит выделить исследования ДНК, которые проводят в связи с планированием или рождением ребенка. Чаще всего родители обращаются в лабораторию, чтобы:

  • изучить свою генетическую совместимость, оценить риски наследственных заболеваний потомства;
  • исследовать состояние плода, выявить синдромы и опасные патологии;
  • диагностировать заболевания (и оценить риски) и аллергические реакции у малыша;
  • определить, какие спортивные занятия, какое питание и образ жизни будут наиболее полезны для ребенка, а чего стоит избегать;
  • установить отцовство или материнство.

Этапы исследования

Независимо от выбранного метода молекулярно-генетического исследования, оно будет включать в себя следующие этапы:

  • взятие биоматериала. Как уже было сказано, чаще для исследования используют кровь пациента. Полученный материал маркируют и транспортируют в лабораторию;
  • выделение ДНК/РНК;
  • проведение исследований в соответствии с выбранным методом;
  • изучение и интерпретацию результатов;
  • выдачу заключения.

Методы молекулярно-генетической диагностики

Методы молекулярной цитогенетики

Цитогенетический анализ позволяет выявить наследственные заболевания, психические отклонения, врожденные пороки развития. Суть метода — в изучении хромосом с помощью специальных микроматриц, нанесенных на ДНК-чипы. Для этого из образца крови выделяют лимфоциты, которые затем помещают на 48–72 часа в питательную среду и по истечении этого времени исследуют. Назначают такой анализ нечасто, в основном для изучения причин бесплодия и невынашивания беременности, для уточнения диагноза у детей при подозрении на врожденные заболевания. Анализ очень точен, но достаточно трудоемок и длителен (результат можно получить лишь через 20–30 дней после сдачи).

Достоинство и в то же время недостаток метода — в его специфичности: цитогенетика может выявить лишь небольшое количество патологий (например, аутизм), однако делает это практически без погрешностей.

Молекулярная диагностика методом ПЦР

Полимеразная цепная реакция — метод, изобретенный в 1983 году, по сей день самый популярный и фундаментальный в молекулярной диагностике. Характеризуется высочайшей точностью и чувствительностью, а также скоростью проведения исследования. Молекулярная диагностика ДНК/РНК методом ПЦР позволяет выявить такие патологии, как ВИЧ, вирусные гепатиты, инфекции, передающиеся половым путем, туберкулез, боррелиоз, энцефалит и многие другие.

Для анализа выбирают участок ДНК и многократно дублируют его в лаборатории с помощью специальных веществ. Для диагностики подходит большой перечень биоматериалов: кровь, слюна, моча, выделения из половых органов, плевральная и спинномозговая жидкость, ткани плаценты и т.д.

Метод флуоресцентной гибридизации (FISH)

В данном молекулярном методе объектом исследования становятся уникальные нуклеотидные соединения отдельно взятой хромосомы или ее участок. Для этого используются меченые флуоресцентными маркерами короткие ДНК-последовательности (зонды), которые позволяют выявить фрагменты с атипичными генами. Биоматериал для анализа может быть любой: кровь, костный мозг, плацента, ткани эмбриона, биопсия и т.д. Важно, чтобы образец был доставлен в лабораторию сразу после его изъятия.

Метод особенно активно используют в онкологии (например, для наблюдения за остаточными злокачественными клетками после химиотерапии), а также в пренатальной диагностике (для определения риска развития у плода врожденных пороков), гематологии. FISH-метод очень чувствителен и точен для выявления поврежденных фрагментов ДНК (погрешность около 0,5%), при этом достаточно быстр: результат придется ждать не более 72-х часов. Однако у него есть и недостатки: FISH еще более специфичен, чем микроматричный цитогенетический анализ, и может служить лишь для подтверждения или опровержения предполагаемого диагноза.

Микрочипирование

Этот метод похож на предыдущий — здесь так же используются меченные флуоресцентом последовательности ДНК. Однако эти зонды сначала выделяют из проб, полученных от пациента, и затем сравнивают с образцами, нанесенными на микрочипы. ДНК-микрочип представляет собой основание (стеклянное, пластиковое, гелевое), на которое может быть нанесено до нескольких тысяч микротестов длиной от 25 до 1000 нуклеотидов. Полученные после очистки биоматериала пробы (зонды) совмещают с микротестами на чипе и наблюдают за реакцией маркёров. Результаты исследования готовы через 4–6 дней после забора материала.

Для анализа используется любой биоматериал, из которого можно получить образец ДНК/РНК. Используют такой метод в онкологии и кардиологии (в том числе для изучения генетической предрасположенности), он точен и чувствителен, однако в России его применяют редко — в этом его главный минус.

Итак, молекулярная диагностика — неинвазивный и точный метод обследования организма с широким спектром применения в разных областях медицины. Если на Западе исследования ДНК/РНК уже распространены повсеместно, то в России подобную услугу предлагают далеко не все клиники.

Се­год­ня ме­ди­ци­на по­зво­ля­ет уже во вре­мя пла­ни­ро­ва­ния бе­ре­мен­нос­ти узнать о воз­мож­ных рис­ках для бу­ду­ще­го ма­лы­ша, по­это­му не по­жа­лей­те вре­ме­ни и средств — прой­ди­те ге­не­ти­чес­кое ис­сле­до­ва­ние еще до за­ча­тия ре­бен­ка или, если бе­ре­мен­ность ста­ла для вас сюр­п­ри­зом, во вре­мя вы­на­ши­ва­ния. Так вы смо­же­те из­бе­жать мно­жест­ва про­блем для се­бя и для ма­лы­ша в бу­ду­щем.

Молекулярно-генетические исследования, способы их проведения и виды

Молекулярно-генетические методы (методы ДНК –диагностики) – это большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК. ДНК- методы используются в следующих направлениях:

1. Для диагностики моногенных и мультифакториальных наследственных болезней.

2. Для пренатальной диагностики моногенных болезней или пола плода (в случаях Х – сцепленного наследования).

3. В судебной медицине для идентификации личности (геномная дактилоскопия) и установления родства.

4. Для диагностики инфекционных заболеваний.

5. Для диагностики онкологических заболеваний.

Возможности диагностики связаны с осуществлением программы «Геном человека». Перечень моногенных болезней, диагностируемых молекулярными методами, и доступных пренатальной диагностике: муковисцидоз, мышечная дистрофия Дюшенна-Беккера, гемофилия (А и В), фенилкетонурия, болезнь Хантера (мукополисахаридоз), адрено – генитальный синдром , хорея Гентингтона, синдром фрагильной Х-хромосомы и др.

В 1993 году таких заболеваний было 130, в 1994 году – 600, сейчас еще больше. Сейчас возможна диагностика любого наследственного заболевания, ген которого картирован и доступен прямой или косвенной диагностике.

В перспективе будет возможно говорить о «генетическом паспорте новорожденных», то есть о том, что уже вскоре после рождений с помощью автоматизированной системы удастся проанализировать весь спектор наиболее распространенных заболеваний как моногенных, так и мультифакториальных.

Молекулярно-генетические методы можно разделить на прямые и косвенные.

Прямая диагностика проводится в тех случаях, когда строение гена уже изучено. Она включает секвенирование ДНК, регистрацию изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК, трансляцию белкового продукта in vitro и др. Косвенное выявление мутацийприменяется в тех случаях, когда строение гена не известно и вместе с тем имеется информация о других структурах, находящихся рядом с геном – определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и др.

Рассмотрим некоторые из них.

Секвенирование ДНК — это наиболее точный метод, так как позволяет определить строение гена и выявить любую мутацию. Методики секвенирования весьма трудоемки, требуют значительных затрат материалов и времени, в связи с чем не нашли широкого применения в клинической генетике, а применяются главным образом для расшифровки генома человека.

С открытием в начале 70-х годов рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) — ферментов, способных разрезать нити ДНК в строго определенных участках — сайтах рестрикции, исследователи получили возможность выделять более мелкие и в то же время стабильные по длине и легче идентифицируемые фрагменты. Определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (RFLP – restriction fragments length polymorphism) один из распространенных методов ДНК-диагностики. Принцип метода: выделенная ДНК обрабатывается ферментами, которые «разрезают» ее на фрагменты в строго определенных участках (сайтах рестрикции). Патологические мутации могут изменять сайты рестрикции, что приводит к изменению длин полученных фрагментов.

Несколько позже широкое развитие получили различные способы изучения последовательностей ДНК с помощью олигонуклеотидных зондов — искусственно синтезированных коротких цепей нуклеотидов, меченных радиоактивными метками. При определенных условиях указанные зонды могут специфически связываться (гибридизоваться) с комплементарными последовательностями в анализируемой ДНК, свидетельствуя тем самым о присутствии искомого фрагмента.

Выделение ДНК для исследования указанными методами представляет собой достаточно трудоемкую процедуру. Во-первых, ДНК в клетках содержится в относительно небольших количествах по сравнению с другими веществами, поэтому для получения очищенных препаратов требуются сложные и дорогие методы. Во-вторых, молекулы ДНК, особенно эукариот, имеют значительную длину и представляют собой весьма хрупкую цепь, которая при различных биохимических манипуляциях оказывается так или иначе поврежденной.

Для выделения ДНК полученный биологический материал обрабатывают протеолитическими ферментами, чтобы удалить все белки. ДНК адсорбируют на пористых носителях или экстрагируют органическими растворителями, после чего следует многократное очищение. При этом получают всю ДНК клеток (геномную ДНК).

Исследователя обычно интересует только определенный, специфический участок ДНК, который трудно идентифицируется среди множества других, в том числе нетранскрибируемых ДНК-последовательностей. Эта задача решалась с помощью трудоемкого подхода — путем клонирования фрагментов ДНК (т.е.размножения) в различных организмах (т.н. векторах), чаще всего в фагах (вирусах бактерий) или во внехромосомных наследственных единицах — плазмидах. При этом интересующий фрагмент молекулы ДНК какого-либо организма вначале встраивался в геном фага либо в кольцевую ДНК плазмиды при помощи специальных ферментов — рестриктаз, нуклеаз, полимераз и лигаз, после чего происходило заражение бактерий фагом (трансдукция) или внесение плазмидной ДНК в цитоплазму микроорганизма (трансформация). Размножение бактерий тем самым вело к накоплению достаточно больших количеств интересующих исследователя фрагментов ДНК.

Однако процедуры молекулярного клонирования весьма трудоемки, требуют работы с радиоактивными веществами, высокой степени очистки ДНК, поэтому они практически не вышли за рамки крупных специализированных лабораторий, хотя необходимость исследования ДНК на уровне нуклеотидных последовательностей давно стала потребностью практического здравоохранения.

Указанные трудности были преодолены с открытием в 1983 г. К.Б.Мюллисом (США) метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), который нашел широкое применение в самых различных областях практической медицины.

Молекулярно-генетические исследования

Цель проведения молекулярно-генетических методов исследования – определение наличия модификаций и изме­нений в некоторых хромосомах, ДНК-участках или генах. Широкое использование на практике этот способ работы с ДНК получил в 70-80 гг. прошлого столетия.

Когда назначают молекулярно-генетические исследования

Молекулярно-генетические исследования помогают диагностировать:

  1. Моногенные генетические заболевания;
  2. Вероятность развития онкологических болезней;
  3. Наличие факторов, провоцирующих мультифакторные болезни.

Определение риска развития онко-процессов при помощи молекулярно-генетического исследования выявляет:

  • Риск развития рака желудка и щитовидной железы;
  • Вероятность возникновения рака толстой кишки и ранних стадий этого заболевания;
  • Генетическую предрасположенность к развитию рака тела матки, яичников, молочной и предстательной железы;
  • Наличие рекомбинации генов ABL/BCR, выявляемых при лейкозах;
  • Наличие предпосылок, обеспечивающих эффективность противоопухолевой терапии гефатинибом при наличии немелко-клеточного рака .

Проводя молекулярно-генетические тесты на наличие генетически обусловленных предпосылок развития мультифакторных заболеваний, удается выявить риск развития:

  • гипертонической болезни;
  • преэклампсии;
  • ревматоидного артрита;
  • остеопороза;
  • нарушений липоидного обмена;
  • сахарного диабета 1 и 2 типа;
  • болезней репродуктивной системы.

С помощью этого метода оценивают метаболизм и оправданность применения тех или иных лекарственных препаратов.

Кому назначают молекулярно-генетические исследования

Молекулярно-генетические тесты показаны лицам:

  • страдающим бесплодием;
  • подвергающимся воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды;
  • имеющим в роду близких родственников, страдающих онкологическими, психическими, сосудистыми и эндокринными заболеваниями.

Как проводится молекулярно-генетический тест

Первый этап молекулярно-генетического анализа очень важный и заключается в получе­нии РНК и ДНК образцов, которые являют собой отдельные фраг­менты ДНК клетки или всю её цепочку. Для выделения необходимого количества фрагментов используют способ амплифицирования, то есть их размножения путем полимеразной цепной ре­акции (фермента­тивная репликация).

Для анализа молекул ДНК требуется их предварительное деление на части и обработка бактериальными эндонуклеазами (рестриктазами) – ферментами, которые могут разрезать двойную спираль ДНК на части по 4-6 пар.

Фрагменты ДНК разделяют по длине и размеру при помощи специального геля (полиакриламидного и агарозного), применяя электрофорез. Под действием последнего они перемещаются вниз по гелю с разной скоростью, оставляя за собой дискретную полосу.

Молекулярно-генетические исследования наследственных патологий также ис­пользуют с целью изучения человеческого генома. Блот-гибридизация по Саузерну позволяет в данном случае определить необходимые для этого особые фрагменты ДНК. При этом вначале прибегают к денатурации ДНК, в результате чего получают фрагмен­ты в виде одной цепочки и их переносят на фильтр (нейлоновый или нитроцеллюлозный), который замочен в буферном растворе.

Гель, на котором находятся ДНК-фрагменты, переносят на фильтровальную бумагу с солевым раствором (с высоким %концентрации). Сверху на­кладывается по очереди нитроцеллюлозный фильтр и фильтровальная, но сухая бумага (для впитывания солевого раствора). В итоге одноцепочечные ДНК остаются на фильтре в таком же положении как на геле.

Для выявления необходимых фрагментов проводят процедуру гибридизации ДНК с клониро­ванным его фрагментом или радиактивным ДНК-зондом. Полученный результат этой процедуры обнару­живается посредством радиоавтографии, благодаря которой все комплементарные зонды после­довательности ДНК отражаются в ви­де радиоактивной полосы.

Метод Саузерна позволяет воссоздать рестрикционную карту гено­ма человека в определённой части гена. Это дает возможность обнаружить наличие любых дефектов в самом гене. Разработанные методы считаются довольно эффективными и позволяют проводить сверхточную диагностику наследственных заболеваний. С этой целью из эмб­риональных клеток, которые содержатся в амниотической жидкости, выде­ляют ДНК. В последующем ее гибридизируют, применяя Саузерн-блоттинг с радиоактив­ным ДНК-зондом. В итоге очень легко распознать аномальный эмб­рион, потому что его ДНК гибридизируется исключительно с ДНК-зондом, который является комплементарным мутантной последовательности.

Современная наука использует ряд методов для выявления мутаций. Все они делятся на косвенные и прямые молекулярно-генетические способы исследований.

Косвенные способы выявления мутаций используются в случае, если известно по­ложение гена на генетической карте, но не расшифрована его нуклеотидная последовательность.

Прямая диагностика бывает в нескольких видах:

  1. Секвенирование. Это техника выявления нуклеотидной по­следовательности для определения замены оснований в определенном фрагменте.
  2. Блот-гибридизация но Саузерну. Это рестриктный анализ, с помощью которого находят мутации, имеющие нарушения места рес­трикции.
  3. Аллелоспецифическая гибридизация с синтетическим зондом. Данный способ также позволяет выявить в геномной ДНК мутации.
  4. Электрофорез двухцепочечной ДНК в геле (равномерно денатурирующем, нейтральном). Оно являет собой расщепление ДНК на химическом и ферментативном уровне. В тех местах, где непра­вильно сшиты основания обычно определяют группу мутаций.
  5. Изучение электрофоретической подвижности ДНК-мутантных молекул.
  6. Анализ синтезируемого белка с помощью электрофореза. О наличии мутаций судят по изме­нению подвижности белка в системе in vitro.

Также мутации диагностируют с помощью определения полиморфных фрагментов (рестрикционных по длине) в геноме. Для этого применяют ту же технику блот-гибридизации по Саузерну.

Среди прочих типов полиморфизма ДНК также выделяют микросателлиты. Они являют собой корот­кие после­довательности ДНК (тандемно повторяющиеся моно-, ди-, три- и тетрануклеотидные). Они служат маркерами дефектных мутаций или маркерными локусами аллельных вариантов гена в исследовании.

Ген, который ответственный за развитие хореи Гентингтона, тя­желой патологии, был открыт в 1993 г. При этой болезни наблюдается снижение интеллектуального развития, расстройство движений ЦНС у людей после 40 лет. Болезнь является наследственной и передается по аутосомно-доминантному типу, имеет 100 % пенетрантность. Расположен ген болезни в 4-й хромосоме, в корот­ком плече.

Этот ген включает в себя нуклеотидную последовательность в виде много­кратного повторения нуклеотида ЦАГ. У здоровых людей таких повторов в норме 11-34, больные хореей имеют 37-86, но обычно 45. Из этого следует вывод, что хорея Гентингтона – это наследственная патология с мутацией ге­на в многократном увеличении числа его копий (экспансия).

Викторова Юлия, акушер-гинеколог

12,545 просмотров всего, 7 просмотров сегодня

Методы молекулярно-генетического анализа

Исследования генома микроорганизмов потребовали разработки высокочувствительных и точных методов молекулярно-генетического анализа. Основной целью этих методов является идентификация изучаемых генов, определение последовательности их ДНК (секвенирование), а также изучение их функционирования на молекулярном и клеточном уровнях.

Одним из основных способов генетического анализа является метод молекулярной гибридизации. Он обладает высокой чувствительностью, позволяя выявить до 10 -10 г специфической нуклеиновой кислоты в 1 мл материала.

Молекулярная гибридизация основана на взаимодействии комплементарных цепей ДНК или РНК и образовании двунитчатых структур. Она может происходить между комплементарными молекулами ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК.

Ее проводят следующим образом:

Осуществляют деспирализацию генетического материала с образованием одноцепочечных структур;

Проводят адсорбцию материала на твердой фазе (обычно на нитроцеллюлозной мембране);

Обрабатывают материал зондом. Зонд – это специфическая искусственно полученная короткая последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарная изучаемой нуклеиновой кислоте и несущая какую-либо метку (обычно радиоактивный фосфор);

Пробы помещают в счетчик радиоактивности и учитывают. Если материал содержал искомую последовательность нуклеиновой кислоты, то это определяется по степени радиоактивности пробы.

Недостатком данного метода является короткий период полураспада изотопа фосфора и необходимость в специальном оборудовании и применении мер защиты. Поэтому наиболее перспективно использование колориметрических реакций, где применяется ферментативная метка.

Одним из наиболее распространенных вариантов молекулярной гибридизации является блотинг по Саузерну (Southern blotting, от англ. blot – пятно, отпечаток). Им выявляют фрагменты ДНК, разделенные электрофорезом в агарозе. Для этого очищенную ДНК нарезают на фрагменты рестриктазами (рестрикционными эндонуклеазами). Далее проводят электрофорез ДНК. После электрофореза фрагменты переносят с агарозы на нитроцеллюлозные фильтры. Фильтры обрабатывают зондом и затем оценивают положение искомого гена на фильтре.

Если в качестве материала изучается РНК, то применяют аналогичный способ, который получил название Northern blotting – «северный блотинг». Его используют для обнаружения фрагментов РНК.

Гибридизация in situ используется для выявления ДНК и РНК в клетках. Для нее применяют замороженные срезы ткани, полученной при биопсии, а также другие клеточные структуры.

В начале 80-х годов К.Мюллисом был разработан способ, позволивший значительно увеличить чувствительность метода молекулярной гибридизации. Речь идет о так называемой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Суть способа заключается в следующем: исследуемый материал, содержащий 2-спиральную нуклеиновую кислоту (ДНК), нагревают до 90-100 0 С, вызывая тем самым расхождение 2-х-цепочечной ДНК на отдельные цепи. В смесь добавляют набор всех пуриновых и пиримидиновых оснований, праймеры и термостабильную ДНК-полимеразу. Праймерами называются синтетические короткие участки ДНК, комплементарные той нуклеиновой кислоте, которую амплифицируют. Праймеры обычно располагаются с концов (фланкируют) амплифицируемый участок ДНК и служат затравками (инициаторами) полимеризации.

Реакционную смесь охлаждают (обычно до 70-76 0 С). Праймеры присоединяются к разошедшимся цепям. При этом термостабильная полимераза достраивает 2 разошедшиеся цепи ДНК до полных молекул, удваивая тем самым исходное количество генетического материала. Удвоенное количество генетического материала подвергают повторному расхождению и удвоению и так далее. Проведя несколько десятков циклов полимеризации, можно поднять содержание ДНК в исследуемом материале до порога обнаружения. После этого нуклеиновую кислоту выявляют обычной молекулярной гибридизацией.

ПЦР является самым чувствительным из имеющихся в настоящее время методов, позволяя обнаружить всего 100 молекул ДНК или РНК в 1 мл сыворотки. В случае определения молекул РНК (например – вируса ВИЧ) для проведения полимеразной цепной реакции предварительно получают его ДНК-копию с помощью фермента обратной транскриптазы. Затем ход реакции не отличается от вышеописанного.

Другой важной группой генетических методов исследования являются методы определения первичной последовательности нуклеиновых кислот (секвенирование).

Существует несколько методов секвенирования. Одним из них является способ Максама и Гилберта. Сущность его заключается в следующем: из исходного материала выделяют ДНК и переводят ее в одноцепочечную форму. Четыре исходных набора материала обрабатывают различными химическими соединениями, специфически реагирующими только с определенными нуклеотидами в цепи ДНК: пуриновыми (аденином, гуанином) или пиримидиновыми (тимином и цитозином). При этом цепь ДНК разрезается по соответствующему нуклеотиду, который становится концевым. В результате получается 4 набора различных по длине олигонуклеотидов, причем каждый из них заканчивается на соответствующее основание, которое метят радиоактивным фосфором. Затем материал подвергают электрофорезу в агарозе по четырем параллельным трекам. После этого гель накладывают на рентгеновскую пленку и экспонируют (проводят радиоавтографию). Сопоставляя все 4 трека, определяют последовательность исходного фрагмента ДНК.

Дата добавления: 2015-04-24 ; Просмотров: 470 ; Нарушение авторских прав?

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Молекулярно-генетические методы исследований

Молекулярно-генетические методы исследований стали достижением биологической науки второй половины XX ст. Они позволяют изучить саму структуру ДНК, определить сходства и отличия ДНК разных организмов, их участков, найти повреждения в структуре ДНК и даже расшифровать первичную последователь­ность оснований в ДНК или РНК.

Молекулярно-генетические исследования — это разнообразные методы и методики. Общим для всех их является, во-первых, выделение образца ДНК исследуемого организма и, во-вторых, использование генно-инженерных технологий. Для получения ДНК берут любые клетки, которые содержат ядра. Чаще всего у человека — это лейкоциты крови, клетки слизистой оболочки рта (для их получения достаточно легко провести шпателем по внутрен­ней поверхности щеки) или, если изучается геном эмбриона, — околоплодная жидкость.

Преимущество молекулярно-генетических методов в том, что для их проведения необходимо совсем незначительное количество материала. Изучить ДНК организма можно по одному единственному волосу, ничтожному мазку крови, малюсенькому кусочку кожи или кости.

Для проведения молекулярно-генетических исследований почти всегда используют только небольшой фрагмент ДНК, содержащий интересующие гены. Для получения такого фраг­мента применяют специальные ферменты рестриктазы (от лат. рестрикций — ограничение). Их особенностью является то, что они режут молекулу ДНК в строго определённом месте. Используя наборы разных рестриктаз, удаётся вырезать из молекулы ДНК нужные фрагменты небольшого размера.

Следующий этап — увеличение количества полученных фраг­ментов ДНК. Это возможно благодаря способности молекулы ДНК к самоудвоению. Увеличение копий ДНК называют ампли­фикацией (от лат. амплификацио — усиление, увеличение).

В живом организме амплификация — естественный процесс репликации ДНК, а в лабораторных условиях его подменяет специальная методика — полимеразная цепная реакция (ПЦР). Полученная ДНК является материалом для исследований.

Современные молекулярно-генетические методы позволяют с наивысшей точностью установить родственные отношения двух особей, в том числе и давно умерших людей, если доступны их биологические материалы (кости, волосы). Суть методики проста: сравнивая определённые участки ДНК разных людей, определяют степень сходства последовательности нуклеоти­дов этих участков. Именно так были идентифицированы члены погибшей семьи последнего российского императора Николая II. Материал с сайта http://worldofschool.ru

Молекулярно-генетические методы, благодаря их большой точности, используют в судебной медицине, например, метод «генетических отпечатков пальцев». Из минимального количества биологического материала, найденного на месте преступления (крови, слюны, волос, спермы), выделяют ДНК и расщепляют её на фрагменты. Эти фрагменты разделяют в специальных носителях, получая картинку расположения полос, которую и называют генетическими отпечатками пальцев. Она уникальна для каждого человека, совпадая только у однояйцевых близ­нецов. Ведь каждый человек по нюансам нуклеотидных последователь­ностей, как и по папиллярным узорам, уникален. «Генетические отпечатки пальцев» вносят в специальную базу и точно так же, как настоящие отпе­чатки пальцев сравнивают с «генетическими отпечатками пальцев» подо­зреваемого. Этот метод также позволяет установить отцовство — у роди­телей и детей отпечатки в определённой степени похожи.